2009年Hans Clevers實驗室對腸道培養(yǎng)體系進行了開創(chuàng)性地研究（Sato et al.,2009 )，2011年Sato等人發(fā)表了第一個描述完整分離腸隱窩以及后續(xù)培養(yǎng)的研究方案（Sato et al.,2011)。為了降低培養(yǎng)成本、簡化培養(yǎng)流程，后續(xù)有多個文獻報道了對此培養(yǎng)方法的改進（Mache et al.,2013;Vandussen et al.,2015;Zietek et al.,2015)，包括降低一些生長因子的濃度，或利用重組細胞系來生產(chǎn)Wnt3a、Noggin和R-Spondin1的條件培養(yǎng)基等。

目前常用的隱窩分離方法有兩種。一種方法是利用EDTA從基底膜上分離隱窩，另一種方法則采用膠原酶消化腸道組織。本文將詳細闡述兩種方法提取小鼠及人源組織中隱窩的步驟及要點。

48孔細胞培養(yǎng)板、離心管（50mL)、細胞培養(yǎng)皿（6cm和10cm）、移液器（規(guī)格為10μL、200μL、1000μL和5000μL）、無菌吸頭（規(guī)格為10μL、200μL 、1000μL和5000μL）、無菌鑷子、無菌組織剪、70μm細胞過濾器、手術(shù)刀片。

MatrigengeL Matrix（推薦貨號：082703/082755）；小鼠小腸類器官培養(yǎng)試劑盒（推薦貨號：MA-0817H006）；類器官培養(yǎng)防黏附潤洗液；類器官回收液（用于傳代培養(yǎng)）；75%乙醇溶液；DPBS；雙抗（青霉素、鏈霉素）；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；EDTA溶液（pH=8.0）。

· 配制5mMol/L EDTA溶液：10mL預(yù)冷DPBS溶液中加入

· 100μL0.5M EDTA溶液pH8.0，置于冰上備用。

小鼠小腸類器官原代建立準備物品

（1）按倫理規(guī)定處死小鼠后，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出近胃端3～10cm腸組織，用鑷子盡可能去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預(yù)冷的含雙抗的DPBS溶液中。

小鼠小腸剪取

（2）使用手術(shù)剪將腸管剪開，蕩洗2遍后，腸腔面朝上，一只手使用手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗2次。將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用DPBS清洗2遍。

小鼠小腸刮絨毛

（3）將清洗好的腸段轉(zhuǎn)移至含5mMol/L EDTA的預(yù)冷DPBS中消化，置于4℃孵育20～30min。消化20分鐘可用移液器輕柔吹打腸段，取上清顯微鏡下觀察，待上清出現(xiàn)完整隱窩即可終止消化，若無隱窩可適當(dāng)延長消化時間，盡量不超過30分鐘。

（4）消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)2次以去除EDTA。

（5）用5mL移液管在預(yù)冷的0.1%BSA的DPBS的培養(yǎng)皿或50mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管尖以產(chǎn)生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液進行70μm濾網(wǎng)過濾。

濾網(wǎng)過濾后的組織懸液鏡檢圖

（6）收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，300g離心力4℃離心3min。

（7）棄上清，使用1mL0.1%BSA的DPBS重懸組織沉淀，取20μl懸液進行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300g離心力4℃離心3min，棄上清后置于冰上。

（1）用適量的Matrigengel Matrix重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10μL Matrigengel Matrix懸液包含70至100個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超30以避免Matrigengel Matrix過早凝固。（Matrigengel Matrix稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigengel Matrix的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性）。

（2）將Matrigengel Matrix和組織細胞的混合懸液點入48孔板底部正中央，每孔15μL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（為防止Matrigengel Matrix室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成）。

基質(zhì)膠與細胞混合液點板

（3）將接種完成后的培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigengel Matrix凝固。

（4）待Matrigengel Matrix 完全凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基，48孔板每孔250μL，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

（5）將培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（6）每3天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應(yīng)避免破壞Matrigengel Matrix，密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)。

該實驗流程適用于人腸壁全層組織，大約需10cm²大小，所需試劑體積及孵育時間需根據(jù)實際組織的大小作出相應(yīng)調(diào)整。

剪刀、鑷子(鈍頭)；培養(yǎng)皿；載玻片；50mL離心管；1.5mL EP管；70μm細胞篩；96孔板(平底)；離心機；搖床；1000/100μL槍頭；顯微鏡；24孔板

不含Ca²+/Mg²+的HBSS；0.5M EDTA溶液；青霉素/鏈霉素(雙抗，AA)；?；|(zhì)膠；?；锶诵∧c類器官培養(yǎng)基套裝

· MatrigengeL Matrix（4℃化凍）；

· 模基生物預(yù)冷盒；

· HBSS(4℃預(yù)冷過夜)；

· 1000/100μL槍頭(4℃預(yù)冷過夜)；

· 離心機預(yù)冷(4℃)；冰盒；

· 制備人源隱窩培養(yǎng)基(hCCM)并置于室溫或培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱；

· 制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BCM)(4℃預(yù)冷)；

· 將24孔板置于培養(yǎng)箱預(yù)熱。

· 1個培養(yǎng)皿；

· 2個50mL離心管內(nèi)加入30mL HBSS(加入1%雙抗)，標記樣本編號，置于4℃預(yù)冷；

· 5個50mL離心管內(nèi)加入20mL HBSS置于4℃預(yù)冷，標記樣本及組分編號；

· 2個50mL離心管(標記樣本編號)；

· 1~2個70μm細胞篩；

相較于EDTA法，該方法成本稍低，無需選擇特定的組分進行培養(yǎng)也可培養(yǎng)出大量體積較大的隱窩，但膠原酶酶法需要嚴格的實驗流程，同時有被成纖維細胞污染的風(fēng)險。

· 2個培養(yǎng)皿；

· 1~2個50mL離心管內(nèi)加入20mL PBS(加入1%雙抗),標記小鼠編號，置于4℃ 預(yù)冷；

· 1~2個50mL離心管，標記小鼠編號；

· 6個15mL離心管，標記小鼠編號；

· 稱取適量的膠原酶XI于50mL離心管中，-20℃保存

·  1個70μm細胞篩；

（1）按照小鼠腸隱窩分離流程準備整個小腸樣本。

（2）將小腸樣本移至裝有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中。將小腸切成腸段以便操作，用剪刀縱向剪開小腸，將小腸組織移至加入PBS的50mL離心管中，劇烈搖晃離心管5min以清洗組織。這個步驟重復(fù)多次直至清除小腸組織中的黏液及碎片

腸段清洗

（3）將組織移至裝有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，PBS僅需覆蓋培養(yǎng)皿底部，用鑷子及刀片將組織切成小塊（約1mm²）。

（4）用5~10mL移液器將組織塊和PBS移至15mL離心管中，加入預(yù)冷的PBS至10mL, 將離心管翻轉(zhuǎn)5次，靜置使組織塊沉降。小心棄上清，再次加入10mL預(yù)冷的PBS，重復(fù)清洗步驟直至上清澄清(大約需4次)。

準備膠原酶XI溶液：將14mg膠原酶XI加入預(yù)熱的40mL DMEM 6546，無菌過濾膠原酶溶液至50mL離心管中，置于37℃水浴鍋中。

（5）棄去上清，盡可能不殘留PBS，加入10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液，混勻。

（6）在37℃水浴中孵育4.5min，小心翻轉(zhuǎn)離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（7）加入10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育4.5min，搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（8）加入10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育15min，分別在4.5min、9.5min、14.5min后搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（9）加入10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育15min，分別在4.5min、9.5min、14.5min后搖晃離心管30s，靜置45秒使組織塊沉降。

（10）取出上清移至新的15mL離心管中，100g、4℃離心2min，棄上清，10mL預(yù)冷PBS重懸沉淀。

（11）100g、4℃離心2min，棄上清，10mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，將重懸液通過70μm細胞篩至適當(dāng)標記的50mL離心管中。

（12）取10μL重懸液于顯微鏡下進行隱窩計數(shù)，估算隱窩總個數(shù)(10mL 中隱窩總個數(shù)=10μL中隱窩個數(shù)×1000)。按每孔種100~200個隱窩計算所需重懸液體積，移至適當(dāng)標記的50mL離心管中。

（13）按照小鼠腸隱窩提取流程中的第12~14步驟進行后續(xù)實驗。

（1）按照小鼠腸隱窩分離流程準備結(jié)腸樣本。

（2）按照小腸隱窩分離流程中第2~4步驟進行實驗。

準備膠原酶XI溶液：將14mg膠原酶XI加入預(yù)熱的40mL DMEM  6546，無菌過濾膠原酶溶液至50mL離心管中，置于在37℃水浴鍋中。

（3）棄上清，盡可能不殘留PBS，加入10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液，混勻。

（4）在37℃水浴中孵育9.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（5）加入10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育14.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（6）加入10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育15min，分別在4.5min、9.5min、14.5min后搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分1，將其移至適當(dāng)標記的15mL離心管中。

（7）加入10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育15min，分別在4.5min、9.5min、14.5min后搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分2。

同時，將組分1于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，置于冰上。

（8）將組分2的上清移至15mL離心管中，于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預(yù)冷PBS 重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預(yù)冷PBS重懸沉淀。

（9）將組分1重懸液與組分2重懸液混合得到10mL隱窩懸液，通過70μm細胞篩至適當(dāng)標記的50mL離心管中。

（10）取10μL重懸液于顯微鏡下進行隱窩計數(shù)，估算隱窩總個數(shù)(10mL中隱窩總個數(shù)=10μL中隱窩個數(shù)×1000)。按每孔種100~200個隱窩計算所需重懸液體積，移至適當(dāng)標記的50mL離心管中。

（11）按照小鼠腸隱窩提取流程中的第12~14步驟進行后續(xù)實驗。

使用膠原酶分離人源腸隱窩的實驗流程與小鼠腸隱窩的流程非常類似，器械、試劑、溶液及準備工作與小鼠腸隱窩的分離相同。下述的實驗方案適用于約5.5cm²大小的腸組織樣本。

（1）用預(yù)冷的PBS清洗腸組織。

（2）將組織移至裝有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，用剪刀和鑷子小心去除肌層及黏附的結(jié)締組織。

（3）棄PBS，取新的預(yù)冷PBS清洗組織，再重復(fù)2次。

（4）按照小腸隱窩分離流程中第3~5步驟進行實驗，膠原酶溶液中膠原酶XI的使用劑量如下：

· 小腸組織：15mg/40mL DMEM 6546

· 大腸組織：20mg/40mL DMEM 6546

（5）在37℃水浴中孵育9.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分1，將其移至適當(dāng)標記的15mL離心管中。

（6）用10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液重懸組分1的沉淀，混勻后在37℃水浴中孵育9.5min,劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分2，將其移至適當(dāng)標記的15mL離心管中。

同時，將組分1于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，置于冰上。

（7）用10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液重懸組分2的沉淀，混勻后在37℃水浴中孵育9.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分3，將其移至適當(dāng)標記的15mL離心管中。

同時，將組分2于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，置于冰上。

（8）用10mL預(yù)熱的膠原酶XI溶液重懸組分3的沉淀，混勻后在37℃水浴中孵育9.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分4，將其移至適當(dāng)標記的15mL離心管中。

同時，將組分3于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，置于冰上。

（9）將組分4的上清于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預(yù)冷PBS重懸沉淀。

（10）將組分1~4的重懸液混合后，通過70μm細胞篩至適當(dāng)標記的50mL離心管中，并于350g、4℃離心3min。

（11）按照人源腸隱窩提取流程中的第13~16步驟進行后續(xù)實驗。

小鼠和人源類器官培養(yǎng)的主要區(qū)別在于其培養(yǎng)基組分的不同。小鼠小腸類器官培養(yǎng)所需要的補充因子最少，人源類器官培養(yǎng)需要多個生長因子和抑制劑以維持生長，這對于前幾天的培養(yǎng)尤為重要。在培養(yǎng)基中加入Wnt3a可抑制分化，增加干細胞/擴增細胞的比例，促進類器官囊泡樣生長。減少Wnt3a用量、撤掉SB202190或加入可抑制Notch通路的γ-分泌酶抑制劑可誘導(dǎo)類器官向不同的腸上皮細胞譜系分化。

添加與不添加Wnt3a的培養(yǎng)基培養(yǎng)下小鼠小腸類器官生長情況對比圖

48孔細胞培養(yǎng)板、離心管（50mL)、細胞培養(yǎng)皿（6cm和10cm）、移液器（規(guī)格為10μL、200μL、1000μL和5000μL）、無菌吸頭（規(guī)格為10μL、200μL 、1000μL和5000μL）。

?；锘|(zhì)膠；類器官培養(yǎng)防黏附潤洗液；類器官回收液（用于傳代培養(yǎng)）。

（1）將培養(yǎng)板置于冰上，吸出類器官培養(yǎng)基，不要破壞含有類器官的類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠。

（2）在每個孔中加入10倍體積冷的（2~8°C) 類器官回收液。如，取5μl基質(zhì)膠，加入50μl回收液。

（3）在2~8°C或冰上孵育50分鐘，用手輕輕搖動。（孵育10~15分鐘后，您可以用細胞刮板或移液管輕輕取出基質(zhì)膠圓頂，以加速恢復(fù)過程。一旦孔底的基質(zhì)膠圓頂狀形狀消失，類器官開始漂浮在溶液中，孵育即完成。）

（4）輕輕地將孔內(nèi)的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾x心管中，單層類器官應(yīng)格外小心處理，因為細胞很容易脫落。

（5）以25~50xg的離心力，在2~8°C下離心，離心管3分鐘，將類器官離散成顆粒，并丟棄上清液。

（6）用10倍類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基在室溫下清洗一次類器官，重復(fù)上面的第5步。

（7）根據(jù)密度加入對應(yīng)批次的細胞外基質(zhì)重懸類器官碎片，冰上混勻，取15μL混合懸液點入48孔板中央。

（8）將接種完成后的培養(yǎng)板37℃凝固15min左右，沿壁緩慢加入250μL/孔類器官完全培養(yǎng)基。

（9）將細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每天于倒置顯微鏡下觀察類器官的生長狀態(tài)，每2～3天更換完全培養(yǎng)基。（此時顯微鏡下可觀察到，細胞碎片均已清除。）

?；锘罱M織細胞保存液

（5）在分離過程中使用的離心管和移液管使用前用類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液潤洗，以便提升隱窩回收率。

?；镱惼鞴倥囵B(yǎng)潤洗液

（6）類器官回收液需提前預(yù)冷至2-8°C。

?；镱惼鞴倩厥找?/span>

常用的實驗方法如定量PCR、蛋白印跡、流式細胞術(shù)或免疫熒光(IF)/免疫組織化學(xué) (IHC) 染色等均可用于分析腸道類器官。類器官既可作為細胞團新鮮固定，也可以包埋在OCT或石蠟中從而廣泛應(yīng)用于抗體檢測。一般來說，腸道類器官培養(yǎng)的驗證主要指在mRNA或蛋白質(zhì)水平上檢測不同亞型腸上皮細胞（干細胞、潘氏細胞、杯狀細胞、腸吸收 細胞、腸內(nèi)分泌細胞、tuft細胞）標志物的表達。